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生物防腐剂——乳酸菌素
来源:欧凯米特研究中心   2009年7月21日

                                                                            转自:《中国食物与营养》  
 
       防腐剂是食品中不可缺少的,从某种意义上说,没有防腐剂就没有食品工业。而要达到这个目的的唯一办法就是在食品加工的过程中添加适量的防腐剂。然而随着社会经济的发展和人们生活水平的提高,人们对食品的安全性的要求越来越高,食品防腐剂的安全卫生条件日益受到人们关注,消费者对添加化学防腐剂的食品心存顾忌。因此,寻求广谱、高效、低毒、天然的食品防腐保鲜剂是目前食品科学研究中的热点之一。乳酸菌素是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有生物活性的蛋白质、多肽或前体多肽,它对其它相近种类的细菌具有抑制作用。乳酸菌素可以抑制食品中的致病菌和腐败菌,包括蜡状芽孢杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、单核细胞增生利斯特氏菌、金黄色葡萄球菌等。乳酸菌素一般是带正电荷的小分子蛋白(30~60个氨基酸残基),大部分乳酸菌素对热稳定、具有高等电点和亲水特性,可以与食品一起在加热处理时使用、减少加热时间、节省食品加工过程中的能耗,降低营养成分的破坏程度。它们普遍呈现不可逆的杀菌作用方式,在食品中稳定、可在人体内进行生物降解和消化,对健康无害且在低浓度下具有活性。这引起了人们极大的兴趣,可以通过它来控制食品中的某些腐败菌和病原菌。
 
 1  乳酸菌素概述
1.1  乳酸菌素的发现及其开发利用现状
        早在1928年,L.A.Rogers等在美国首次报道,发现乳酸链球菌的代谢产物能抑制部分细菌;1933年在新西兰和1944年在英格兰也有相似的报道;1947年英国的Mattick A.T.R认识到血清学N群中一些乳酸链球菌(Streptococcus lactis)产生具有蛋白质性质的抑制物,并将其命名为“Nisin”,取自“Ninhibitory substance”;1951年Hirsch的研究表明,Nisin可被用做食品生物防腐、保鲜以控制G+菌的污染;1952年Mcclintock等应用类似的方法进行加工干酪的Clostridium控制实验,在英格兰西南部Clostridium引起加工干酪的损失在总量的30%以上,通过在产品混合物中加入含Nisin的乳发酵剂,3个月内该类问题很快减少,几乎完全消失;1953年Nisin的第一批商业产品——Nisaplin在英国面市;1969年FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会批准Nisin可作为一种食品添加剂;1970年WHO的微生物标准委员会制定Nisin国际标准计量单位为IU。1980年Nisin在啤酒、葡萄酒以及乳酸菌腐败防止方面表现出了巨大潜力;1990年我国卫生部食品监督部门签发了Nisin在国内使用的合格证明书,同时被列入国际GB2760-86的1990年增补品种中,可用于罐头食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品中。目前,已经有60多个国家和地区批准Nisin可作为一种纯天然食品防腐剂、保鲜剂使用[5]。
 
1.2  乳酸菌素的种类
1.2.1  Lantibiotics类 
        这是一类含有19~50个氨基酸分子的肽类,并具有诸如:羊毛硫氨酸(Lanthionine)、β-甲基羊毛硫氨酸(β-methyllanthionine)、脱氢酪氨酸(dehy-drobutyrine)、脱氢丁氨酸(DHb)和脱氢丙氨酸(dehydroalanine,Dha)等非编码氨基酸。Lantibiotics又可再细分为2个亚类:一种是带有正电荷、疏水基团的肽类,它可以在细胞膜上形成通道,如nisin、lactacin481;另一种是球状肽类,它不带电荷或者带负电荷,如mersacidin,actagardine等。
1.2.2  小分子热稳定肽(SHSP) 
      这是一类分子量小于10Ku,疏水的具有膜活性的肽,其又可以分为3个亚类:(a)N-末端氨基酸序列为Tyr-Gly-Asn-Val,并由2个半胱氨酸所构成的S-S桥具有抗李斯特杆菌活性,这类乳酸菌素包括:Pediocin PA-1,leucocin A,mesentaricinY105,carnobacteriocin A、BM1和B2,sackcin A,sackcin P,enterocin A。(b)孔道复合物由2个具有不同氨基酸序列的肽类寡聚体形成,其又可分为2类。第一类每一个多肽都有活性,但另一个多肽的存在会增强它的活性,其中Lactacin F是代表。另一类型是活性依赖于2个多肽,任何一个多肽单独都没有活性,Lactococcin G是其中的代表之一,其中Lactacin F是代表。(c)能被硫醇激活、活性基团要求有还原性半胱氨酸残基,其中Lactoccocin B是唯一的代表。
1.2.3  大的、热不稳定的细菌素 
      这类蛋白分子量大,通常大于30Kda,100℃、30min加热使之失活。只有少数此类细菌素有较为详细的报道。这类细菌素包括:helveticin J,lactiin A,lactcin B,casecin 80和acidophilucin A。
 
1.3  乳酸菌素抑菌作用机理
      乳酸菌素是在乳酸菌代谢过程中合成并分泌到环境中的一类对革兰氏阳性菌(尤其是亲缘性较近的细菌)具有抑制作用的杀菌蛋白或多肽。而具有杀菌活性的主要是Lantibiotics类和大分子热不稳定蛋白(LHLP)乳酸菌素。可有效的抑制革兰氏阳性菌如一些腐败菌、致病菌和芽孢菌,而对革兰氏阴性菌起的作用不大,甚至不起作用。但食品经UHP和PET处理或添加EDTA或柠檬酸盐可以使乳酸菌素有效的抑制革兰氏阴性菌,这说明乳酸菌素作用的是细菌膜。不同的乳酸菌素由于结构不同,其活性和对细胞膜的作用方式也不同。
1.3.1  Lantibiotics类 
        这类细菌素的活性部分含有羊毛硫氨酸(A-L-A)甲基羊毛硫氨酸(A-B-A)、脱氢丙氨酸(DHa)和脱氢丁氨酸(DHb)等稀有氨基酸,其活性形式的形成必须经过翻译后的酶修饰。根据分子结构,这类细菌素可分为线型和环型2类,其典型的代表就是Nisin。Nisin是由乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus.lactis.subsp.lactis)分泌的一种线型多肽,对革兰氏阳性菌(包括各种致病菌)有较广的抑制作用,并可使芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌的芽孢对热敏感。目前,乳酸菌素中研究最深、应用最广的就是Nisin,国内外均有许多关于Nisin结构与抗菌机理的综述。Nisin的抑菌作用最初被认为是一种表面活性剂;也有人认为Nisin的作用是由于其中的2个脱水氨基酸(脱水丙氨酸和脱水丁氨酸)与细菌细胞中的酶的巯基发生反应;目前认为除了以上2种原因外,还存在Barrel-stave机制,即孔道形成机制。
1.3.2  小分子热稳定肽(SHSP) 
       近20年来,世界范围的食物源性李斯特菌病不断发生,而小分子热稳定肽(SHSP)类乳酸菌素尤其是(a)类乳酸菌素更是如此。该类乳酸菌素抗菌机理主要是由于细菌素吸附在细胞膜并在其上形成孔道,使得细胞膜的通透性增加从而引起细胞内各种离子的渗漏和能量物质的消耗,导致细胞解体死亡。细胞膜上孔道的形成引起了膜内外离子失衡和磷酸盐的渗漏。膜内外离子的失衡直接造成PMF(质子驱动力Proton motive force)的耗散。另外,消耗细胞内APP和氨基酸也是(a)类细菌素的活性之一。由于其形成的膜孔道要比第一类细菌素小得多,因此(a)类细菌素不能造成APP从膜孔道直接渗漏。APP的消耗可能是为了维持细胞内PMF,ATP的消耗量急剧增加或由于磷酸盐的流失造成的细胞内ATP代谢失衡。有人认为APP消耗的最主要原因在于PMF的耗散,而不是磷酸盐的流失。氨基酸消耗的原因一方面是由于氨基酸的摄取途径被堵塞,另一方面是由于氨基酸通过膜孔道(或和PMF转移系统)渗漏。可以说,PMF的耗散是(a)类细菌素活性的主要原因。
 
1.4  乳酸菌素活性检测方法
       不同乳酸菌所产生的乳酸菌素是不同的,不同的乳酸菌素具有不同的抑菌谱,有的乳酸菌素具有较宽的抑菌谱,而有的乳酸菌素的抑菌谱较窄,甚至没有抑制腐败菌的能力。到目前为止,对乳酸菌素活性即乳酸菌素抑菌能力的检测方法已有许多报道,概括起来,可分为液体检测法和固体检测法。液体检测法主要包括生长延迟期法、比浊法和试管稀释法等。该方法虽能快速得出结果,但由于其操作繁琐已很少使用。目前,乳酸菌素活性的检测主要采用固体检测法,亦称琼脂扩散法(Agar Diffusion Assay),即在无菌平皿中倒入10ml加热融化的素琼脂(2%),待其充分冷却凝固后,放入已灭菌的牛津杯数个,并按一定次序排列整齐。将分装于大试管中的15ml固体检测培养基融化后冷却至50℃左右,放入107个/ml指示菌液1ml,迅速混合均匀,冷却后用无菌镊子取出牛津杯。分别向孔洞里加入等量的相同稀释倍数的乳酸菌素液,30℃培养24h,用游标卡尺准确测量抑菌圈的直径。抑菌圈大小与乳酸菌素活性强弱呈正相关。最常用的有杯碟法(Well Test)、滤纸片法(Disc Diffussion)和点种法(Spot Inoculation)均属此类。
           
2  乳酸菌素在食品工业中的应用
2.1  乳酸菌素在啤酒工业中的应用
       众所周知,在啤酒生产中,酵母的纯种培养和纯种发酵对啤酒的质量至关重要,因此在确定原料和工艺的前提下啤酒质量控制的实质就是杂菌的控制。啤酒腐败微生物中有害乳杆菌和片球菌容易导致啤酒产生丝状混浊,酸味增加,双乙酰超标等质量问题。Nisin对于生长和发酵阶段的啤酒酵母活率没有影响,在低pH、酒花物质的环境,Nisin活性不受影响,但是却能够有效的抑制啤酒中已发现的几乎所有的革兰氏阳性腐败菌,从而提高啤酒的生物稳定性。此外,利用乳酸菌素还可以避免巴氏杀菌所带来的“杀菌味”和“老化味”,从而保持啤酒的新鲜度。随着纯生啤酒的悄然兴起和人们保健需求愈加强烈,利用天然的食品防腐剂正受到人们的青睐,乳酸菌素以其微生物、生理及技术上的优势将会越来越受到酿酒师们的关注[9]。
 
2.2  乳酸菌素在罐头食品中的应用
        在多种蔬菜如番茄、马铃薯、蘑菇、龙须菜、汤料、豌豆等罐头中,使用乳酸菌素。在酸性条件下易溶、稳定、抑菌活性高,能有效阻止抗热微生物的生长,并能降低热处理的强度,降低F0值,提高罐藏食品的营养价值和保持色泽。
 
2.3  乳酸菌素在肉品保藏中的应用
       使用乳酸链球菌素的肉制品有罐装火腿、熏猪肉、咸猪肉、香肠、真空包装的新鲜牛肉等。乳酸菌素还能抑制杂菌生长,如Nisin能很好地抑制肉毒校状芽孢杆菌的生长,乳杆菌素Sakacin
        A能抑制单核细胞增生的李斯特菌,由肉细菌属某些乳酸菌所产生的乳酸菌素能抑制肉毒梭菌和革兰氏阳性细菌,明串珠菌细菌素对李斯特菌、乳球菌、粪肠球菌都有抑制作用,片球菌属产生的细菌素对产气夹膜梭菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌等G+菌以及恶臭假单孢菌、嗜水气单孢菌都具有抑制作用。此外,在加工肉制品中,为了制备受消费者青睐的典型肉色和风味,常加入一定量的硝酸盐,硝酸盐通过硝酸盐还原菌的作用转化为亚硝酸盐,而硝酸盐与体内的胺类物质作用,生成具有致癌的亚硝胺化合物,对人是十分有害的,由于乳酸菌素加入肉制品中,可降低pH值,较低pH值能减少残留的亚硝酸盐,避免对人的危害,保证肉制加工品安全。
 
2.4  乳酸菌素在乳制品中的应用
        牛奶在生产、贮存、加工过程中很容易受到污染。乳酸链球菌素已成功地用于干酪、巴氏灭菌干酪、巴氏灭菌奶、罐藏浓缩牛奶、高温灭菌奶、高温处理风味奶、酸奶等。经实验证实,加入30~50IU/ml的乳酸菌素可以使鲜奶货架期延长一倍。用少量乳酸菌素作为佐剂来生产奶油巧克力,能降低消耗80%,货架期大幅度延长,37℃只能保存3~7d的产品,添加乳酸菌素后可以存放21d,仍能保持原有风味。
 
3  展望
        无论从保健的角度还是从食品防腐剂、保鲜剂发展的角度来看,纯天然食品防腐、保鲜剂取代或者部分取代化学防腐剂是大势所趋势,因为随着社会经济的发展和人民生活水平的提高,人民对健康的重视程度也日益加强。而乳酸菌素作为一种无毒、无任何副作用的天然防腐剂正迎合了人民的需要。并且,乳酸菌素作为一种生物防腐剂还有其自身的优点:它可以采用微生物发酵的方法大量生产,同时乳酸菌素种类繁多,随着高产乳酸菌素菌珠的选育和对乳酸菌素抑菌机理的研究深入,乳酸菌素必将得到更加广泛的应用。但乳酸菌素也存在自身的缺点:效价低、用量大、抗代谢性能差、抗菌时效短、抗菌谱窄等不足之处。所以在应用的过程中,可以有效地将乳酸菌素与其他的防腐剂和保鲜剂混合使用,取长补短。另外我们还应该对抗菌活性物质的产生、结构及其影响因素作系统分析,找出更多的广谱、高效、无毒(低毒)、纯天然的防腐剂。